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[转帖]同济大学证实武汉新冠病毒更易感染亚裔男性

2020-02-08 | 人围观

以下是他们发表在biorxiv论文汉化版武汉2019-nCov的假定受体ACE2的单细胞RNA表达谱于钊上海东方医院,医学院,同济大学学院赵子贤上海东方医院,医学院,同济大学学院 王玉佳上海东方医院,医学院,同济大学学院周跃清上海东方医院,医学院,同济大学学院韦佐上海东方医院,医学院,同济大学学院,上海200433,中国呼吸疾病,广州医学院第一附属医院国家重点实验室,广州510120,中国·doi:https : //doi.org/10.1101/2020.01.26.96.919985本文为预印本,未经同行评审认证[ 这是什么意思?]。抽象全文信息/历史指标预览PDF抽象2019年12月在中国湖北省武汉市发现了一种新型冠状病毒(2019-nCov)。这种新的冠状病毒已在中国导致了数千例致死性疾病病例,国际上正在迅速发现更多的患者。据报道,2019-nCov与SARS-Cov共享相同的受体血管紧张素转化酶2(ACE2)。在此,基于公共数据库和最新的单细胞RNA-Seq技术,我们分析了正常人肺中ACE2 RNA的表达谱。结果表明,ACE2病毒受体表达集中在少量的II型肺泡细胞(AT2)中。令人惊讶地,我们发现该表达ACE2的AT2群体也高度表达了许多正调控病毒繁殖和传播的其他基因。八个样本之间的比较表明,亚洲男性一个在肺中具有非常大量的ACE2表达细胞。这项研究为2019-nCov感染疾病的流行病调查提供了生物学背景,并且可能为未来抗ACE2治疗策略的发展提供信息。到2019年,nCov严重感染可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和败血症,于感染者约15%,造成死亡1,2。一旦与人的呼吸道接触,该病毒的刺突蛋白就可以与敏感细胞的表面受体结合,从而介导病毒进入靶细胞以进一步复制。最近,Xu等人对刺突蛋白进行了建模,以识别2019-nCov的受体,并指出血管紧张素转化酶2(ACE2)可能是该病毒3的受体。ACE2以前被称为SARS-Cov和NL63 4 – 6的受体。根据他们的模型,尽管2019-nCov与ACE2之间的结合强度弱于SARS-Cov与ACE2之间的结合强度,但仍远高于病毒感染所需的阈值。周等 等 进行了病毒感染性研究,结果表明ACE2对于2019-nCov进入HeLa细胞7至关重要。这些数据表明ACE2可能是2019-nCov的受体。受体的表达和分布决定了病毒感染的途径,而感染的途径对于理解发病机理和设计治疗策略具有重要意义。先前的研究已经调查了ACE2在72个人体组织中的RNA表达8。但是,肺是具有多种类型细胞的复杂器官,这种实时PCR RNA谱图基于大量组织分析,无法阐明人肺中每种细胞中ACE2的表达。的ACE2蛋白水平也通过在肺和其它器官的免疫染色调查8,9。这些研究表明,在正常人肺中,ACE2主要由II型和I型肺泡上皮细胞表达。内皮细胞也据报道是ACE2阳性的。然而,免疫染色分析因缺乏信号特异性而闻名,准确的定量分析也是此类分析的另一挑战。最近开发的单细胞RNA测序(scRNA-Seq)技术使我们能够研究每种细胞类型中ACE2的表达,并以单细胞分辨率提供定量信息。先前的工作已经建立了在线数据库,用于对8位正常人肺移植供体的scRNA-Seq分析10。在当前的工作中,我们使用了更新的生物信息学工具来分析数据。总共,我们分析了来自8位成人供体的正常肺组织的43134个细胞。我们进行了无监督的基于图的聚类(Seurat版本2.3.4),并针对每个个体,基于其标记基因表达谱鉴定了8〜11个转录不同的细胞簇。通常,簇包括II型肺泡细胞(AT2),I型肺泡细胞(AT1),气道上皮细胞(纤毛细胞和Club细胞),成纤维细胞,内皮细胞和各种类型的免疫细胞。如图1b所示,使用t分布随机邻居嵌入技术(tSNE)可视化了代表性供体(亚洲男性,55岁)的细胞簇图,并在图1b中证明了他的主要细胞类型标志物表达。图2。Single-cell analysis of normal human lung. a. Characteristics of lung transplant donors for single-cell RNA-Seq analysis. b. Cellular cluster map of the Asian male. All 8 samples were analyzed using the Seurat R package. Cells were clustered using a graph-based shared nearest neighbor clustering approach and visualized using a t-distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) plot." data-icon-position="" data-hide-link-title="0">下载图在新标签页中打开图1.正常人肺的单细胞分析。一种。用于单细胞RNA-Seq分析的肺移植供体的特征。b。亚洲男性的细胞簇图。使用Seurat R软件包分析了所有8个样品。使用基于图的共享最近邻聚类方法对细胞进行聚类,并使用t分布随机邻居嵌入(tSNE)图进行可视化。Violin plots of expression for ACE2 and select cell type-specific marker genes significantly upregulated in distinct lung cell clusters of the Asian male donor. AGER, type I alveolar cell marker; SFTPC (SPC), type II alveolar cell marker; SCGB3A2, Club cell marker; TPPP3, ciliated cell marker; CD68, macrophage marker; PTPRC(CD45), pan-immune cell marker." data-icon-position="" data-hide-link-title="0">下载图在新标签页中打开图2.亚洲男性供体不同肺细胞簇中ACE2和特定细胞类型特异性标记基因表达的小提琴图。AGER,I型肺泡细胞标记物;SFTPC(SPC),II型肺泡细胞标记物;SCGB3A2,俱乐部细胞标记;TPPP3,纤毛细胞标记;CD68,巨噬细胞标记;PTPRC(CD45),全免疫细胞标志物。接下来,我们分析了每个个体中ACE2的细胞类型特异性表达模式。对于所有供体,ACE2在所有人类肺细胞的0.64%中表达。大部分表达ACE2的细胞(平均83%)是AT2细胞。平均1.4±0.4%的AT2细胞表达ACE2。其他表达ACE2的细胞包括AT1细胞,气道上皮细胞,成纤维细胞,内皮细胞和巨噬细胞。然而,它们的表达ACE2的细胞比例低并且在个体之间是可变的。对于代表性供体(亚洲男性,55岁),每个簇中ACE2的表达和细胞类型特异性标志物的表达如图2所示。为了进一步了解表达ACE2的特殊人群,我们进行了基因本体论富集分析,通过将它们与不表达ACE2的AT2细胞进行比较来研究哪些生物学过程与该细胞群有关。令人惊讶的是,我们发现与病毒过程相关的GO明显过量表达,包括“病毒过程的正调控”(P值= 0.001),“病毒生命周期”(P值= 0.005),“病毒体装配”(P值= 0.03)和“病毒基因组复制的正调控”(P值= 0.04)。这些在表达ACE2的AT2中高度表达的病毒过程相关基因包括:SLC1A5,CXADR,CAV2,NUP98,CTBP2,GSN,HSPA1B,STOM,RAB1B,HACD3,ITGB6,IST1,NUCKS1,TRIM27,APOE,SMARCB1,UBP1,CHMP1A NUP160,HSPA8,DAG1,STAU1,ICAM1,CHMP5,D EK,VPS37B,EGFR,CCNK,PPIA,IFITM3,PPIB,TMPRSS2,UBC,LAMP1和CHMP3。因此,似乎2019-nCov已经聪明地进化为劫持该AT2细胞种群以进行繁殖和传播。我们进一步比较了供体及其ACE2表达模式的特征。在表达ACE2的细胞数量与供体的年龄或吸烟状况之间未发现关联。值得注意的是,这两个雄性供体比其他六个雌性供体具有更高的表达ACE2的细胞比例(1.66%对所有细胞的0.41%,P值= 0.07,Mann Whitney检验)。另外,ACE2的分布在雄性供体中也比雌性更广泛:雄性肺中至少有5种不同类型的细胞表达该受体,而雌性肺中只有2-4种细胞表达该受体。该结果与流行病学调查高度一致,该调查表明,大多数确诊的2019-nCov感染患者均为男性(到2020年1月2日,分别为30对11)。我们还注意到,唯一的亚洲捐献者(雄性)比白人和非裔美国人捐献者具有更高的表达ACE2的细胞比例(2.50%比所有细胞的0.47%)。这可能解释了新的冠状病毒大流行和以前的SARS-Cov大流行集中在亚洲地区的观察结果。总之,在当前研究中,我们以单细胞分辨率报道了ACE2在人肺中的RNA表达谱。我们的分析表明,ACE2的表达集中在AT2的特殊群体中,该群体表达了许多有利于病毒过程的其他基因。这个结论与以前的报告不同,前一个报告不仅在AT2中,而且在内皮细胞中也观察到了丰富的ACE2 8。。实际上,据我们所知,有时可以在免疫组织化学分析中对内皮细胞进行非特异性染色。ACE2在AT2种群中的大量表达解释了感染后肺泡的严重损害。在不同人群中,表达ACE2的细胞群数量和分布的不同可以潜在地识别出易感人群。该研究的缺点是供体样本数量少,并且目前的技术只能分析单细胞的RNA水平,而不能分析蛋白质水平。此外,尚不清楚是否还有其他共同受体负责2019-nCov感染,这也可能有助于解释观察到的SARS-Cov与2019-nCov之间的传播能力差异。方法公共数据集(GEO:GSE122960)用于生物信息学分析。首先,我们使用Seurat(版本2.3.4)读取所有样本的组合基因条形码矩阵。我们删除了检测到的基因少于200个或超过6,000个,或者线粒体基因含量 10%的低质量细胞。过滤掉在不到3个细胞中检测到的基因。为了进行标准化,将组合的基因条形码矩阵按总UMI计数进行缩放,再乘以10,000,然后转换为对数空间。使用功能FindVariableGenes识别高度可变的基因。通过在Seurat函数ScaleData中指定vars.to.regress参数,可以退回由UMI数量和线粒体基因百分比引起的变异。细胞中高度可变的基因的表达水平被缩放并沿着每个基因居中,然后,我们通过(1)使用Seurat中的功能PCElbowPlot绘制每个PC的累积标准偏差来确定下游PC的数量,以识别PC编号上的“拐点”,之后连续的PC可以说明度数减小(2)通过使用Seurat中的PCHeatmap函数探索数据集中的异质性的主要来源。基于这两种方法,我们选择了由Seurat软件使用默认参数实现的二维t分布随机邻居嵌入(tSNE)的第一批最高有效PC。我们在Seurat中使用FindClusters来识别每个样本的细胞簇。使用t分布随机邻居嵌入(tSNE)进行聚类和可视化之后,根据标记基因的相似性以及使用Seurat中的BuildClusterTree来测量系统发育同一性的功能,对初始聚类进行检查和合并。在标记基因指导下对最终比对的对象进行细胞簇的鉴定。为了鉴定标志物基因,用Wilcoxon秩和检验通过Seurat中的FindAllMarkers功能进行差异表达分析。至少在簇内25%的细胞中表达且倍数变化大于0.25(对数刻度)的差异表达基因被认为是标记基因。使用Seurat生成tSNE图和小提琴图。在标记基因指导下对最终比对的对象进行细胞簇的鉴定。为了鉴定标志物基因,用Wilcoxon秩和检验通过Seurat中的FindAllMarkers功能进行差异表达分析。至少在簇内25%的细胞中表达且倍数变化大于0.25(对数刻度)的差异表达基因被认为是标记基因。使用Seurat生成tSNE图和小提琴图。在标记基因指导下对最终比对的对象进行细胞簇的鉴定。为了鉴定标志物基因,用Wilcoxon秩和检验通过Seurat中的FindAllMarkers功能进行差异表达分析。至少在簇内25%的细胞中表达且倍数变化大于0.25(对数刻度)的差异表达基因被认为是标记基因。使用Seurat生成tSNE图和小提琴图。致谢这项工作是由左武国家重点研究计划(2017YFA0104600),国家科学基金(左武81770073,左武81570091),同济大学左武中国青年1000人才计划资助的(基础科学研究-跨学科基金和985赠予左W.,上海科学技术人才计划(19QB1403100致左W)和上海市东医院年度助学金。

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